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本试剂盒利用荧光探针O52进行活性氮检测，具有高的灵敏度，良好的选择性，短的响应时间，以及可对检测对象在原位进行实时监控和观察等。更重要的是，这种检测技术对细胞内活性氮的内源性分布不产生巨大的外加干扰，从而能最大程度地得到内源性活性氮变化的真实信息。

一般最好使用新鲜组织样本检测活性氮，反映的是组织当时的活性氮状态。冻存的组织样本的RNS在长期冻存过程中会损失掉，有条件的话就使用新鲜样本，不建议使用冻存的组织样本。已经冻存的组织样本中残余的RNS也可以用本试剂盒检测。

在活性氮存在的条件下，O52探针与活性氮反应生成强荧光物质O52F，O52F发出的绿色荧光强度与组织内活性氮水平成正比，检测O52F的荧光就可以知道组织内活性氮的水平。O52F的荧光最大激发波长是490nm，最大发射波长是516nm。在激发波长488nm，发射波长516nm附近，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪检测O52F荧光，从而测定组织内活性氮水平。


活性氮（reactive nitrogen species，RNS）是指NO与包括活性氧在内的化合物相互作用，生成一系列包括ONOO?及其质子形式过氧亚硝酸(HOONO)等具有高度氧化活性的自由基和硝基类化合物，这些与活性氧相对应的以NO为中心的衍生物称为活性氮。活性氮主要包括氮氧化物一氧化氮（NO）和二氧化氮（NO2）、过氧化亚硝酰阴离子（ONOO·）、亚硝酰氢（HNO）、亚硝酸根离子（NO2-）和氨等。

• 使用方便：可用荧光分光光度计、荧光酶标仪检测；
  
• 背景低，灵敏度高；
  
• 线性范围宽，使用方便。

组分	100T	200T
试剂A：匀浆缓冲液A	100mL	200mL
试剂B：RNS绿色荧光探针（O52）	100μL	200μL

保存：匀浆液2～8℃，探针-20℃避光，有效期6个月。

• 染料长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
  
• 染色液探针为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

荧光分光光度计、荧光酶标仪


荧光分光光度计或酶标仪、离心机、PBS缓冲液/HBSS（无酚红）、蛋白定量试剂盒、荧光测定专用的黑色96孔板

• 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• O52染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
  
• 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
  
• 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

• 试剂准备：
  根据样本数量，用纯水将O52探针10倍稀释，配制成探针工作液。充分混匀，备用。
  
  • 不可以一次性将探针全部稀释。
    
  • 现配现用。
    
  • O52染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
    
  • 微量操作时，注意探针要有效加入稀释液中，避免没有加入。
    
  • 以下步骤使用的探针为此步骤配制好的探针工作液。
• 样本处理：
  
  • 刚取得的新鲜组织样本用PBS洗净。
    
  • 准确称取50mg或100mg组织样本，加入500μL～1mL匀浆缓冲液A，用匀浆机/匀浆器充分匀浆。
• 样本检测：
  
  • 在96孔板中加入190μL匀浆上清液、10μL O52探针，用移液器吹打，使之充分混匀。
    
    • 不同样本的活性氧差异较大，需要根据预实验结果调整探针用量。一般加入2～10μL探针，染色终浓度按试剂盒中探针母液的200～1000倍稀释，200倍稀释适合大多数样本。
      
    • 如果荧光强度太强，超过了检测仪器的量程，可以减少探针用量。保证所有样本探针用量一致即可。
      
    • 此步加入的是经过稀释配制的探针工作液。
      
    • 以酶标仪检测为例。也可以用荧光分光光度计检测，根据所使用仪器决定匀浆液体积和染色容器。
  • 在37℃避光孵育30分钟。
    
  • 置于酶标仪中，后于激发波长为488nm、发射波长530nm检测荧光强度。
    
    • 或使用荧光光度计等其它荧光检测设备。
      
    • 必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。
      
    • 如果荧光强度太强，超过了仪器的检测范围，可以将孵育后的匀浆上清液用纯水稀释后再检测。一般稀释5～50倍。保证所有样本稀释倍数一致即可。
• 蛋白定量：
  
  • 另取50μL上清匀浆液，用PBS大约稀释20～30倍。
    
  • 取100μL进行蛋白定量，测定蛋白浓度（mg/mL）。
• 结果处理：
  以荧光强度（RFU）/蛋白浓度（毫克蛋白）表示组织活性氮强度。
  
  • 数据与蛋白浓度的单位无关。
    
  • 此处以蛋白浓度数据作为校正系数，对不同样品进行均一化处理。
    
  • 荧光强度强则活性氮（RNS）含量高。
    
  • 可以用实验中对照样本的荧光强度值为基准，待测组样本的荧光强度值占对照样本的百分比来比较活性氮（RNS）程度差异。

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